--細 胞 基 本 信 息---

細胞名稱： NK-92(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞)

細胞別稱： NK92; Natural Killer-92; NK-92.05; Neukoplast; aNK

細胞貨號： SNL-405

生長特性： 懸浮

培養(yǎng)條件： MEMα+20% FBS+0.2mM Inositol+0.1mM β-mercaptoethanol+0.02mM Folic Acid+100-200U/mL recombinant IL-2+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

細胞簡介： NK-92細胞是從一位患有急進性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細胞衍生來的一株IL-2依賴型NK細胞株。NK-92細胞對很多惡性細胞有細胞毒性，鉻釋放試驗顯示它能殺死K562細胞和Daudi細胞。NK-92細胞(經過照射以防止增殖)可以有效地用于血液中白血病的體外免疫清掃而不危及血細胞的功能。NK-92細胞有以下特征：CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面標記陽性；CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面標記陰性。NK-92細胞依賴于重組IL-2的存在，低至10U/mL的劑量足以維持增殖；在缺乏IL-2的情況下，細胞將在72小時內死亡。ATCC通過PCR證實該細胞系Epstein-Barr病毒DNA序列呈陽性。NK-92細胞可以用于3D細胞培養(yǎng)、免疫學研究、毒理研究，也是一種合適的轉染宿主。

細胞正常生長形態(tài)照片

NK-92細胞培養(yǎng)注意事項

l NK-92細胞呈聚團懸浮生長，細胞團較大時需要吹打成小團，防止團塊中間的細胞因營養(yǎng)不足而死亡。除非實驗需要，不建議經常將細胞吹散成單個細胞，否則細胞狀態(tài)將變差；

l NK-92細胞對培養(yǎng)基和血清要求高，培養(yǎng)基嚴格按照配方配制，并且應該使用優(yōu)質血清進行培養(yǎng)；

l NK-92細胞對IL-2有依賴性，如果缺少IL-2細胞將很快死亡。需注意IL-2容易降解，若購買商品化完*培養(yǎng)基，要保存得當并在保質期內盡快用完；若自己配制培養(yǎng)基，IL-2可以采用現配現用的方法；

l 建議常備IL-2，當細胞狀態(tài)不佳時，額外向培養(yǎng)基中按200U/mL補充IL-2，可有效改善。

l NK-92細胞對吹打等機械刺激敏感，不要吹打太多次，注意控制吹打力度輕柔；

l NK-92細胞對溫度敏感，培養(yǎng)基、PBS需復溫至37℃再使用。

l NK-92細胞凍存難度較大，建議使用90% FBS+10%DMSO凍存液，凍存密度推薦300萬細胞/毫升，不能過低。凍存液中不必加IL-2。凍存時細胞應吹散成單細胞。

l NK-92細胞計數時算得的細胞的活率不能代表該細胞真實的狀態(tài)。因為培養(yǎng)時存在一些散在的單細胞，這些細胞活性較低，且不能完*去除，導致在計數時細胞整體活率可能不高。細胞狀態(tài)可以通過細胞能否聚團判斷：只要大部分細胞能聚團生長，細胞狀態(tài)就沒有問題。當細胞狀態(tài)不佳時，細胞無法順利聚團。

NK-92細胞換液方法

l 半換液法：

1. 準備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預熱）

2. 將培養(yǎng)瓶豎立靜置一段時間，待細胞沉底；（肉眼觀察細胞沉底情況）

3. 吸頭緊貼液面，小心吸出一半的培養(yǎng)基，轉移到離心管；

4. 900-1000rpm 3min離心，離心管里若有細胞，則用新鮮培養(yǎng)基重懸后放回原瓶；

5. 原瓶補充一半的新鮮培養(yǎng)基。

Tips：建議半換液2-3次后進行離心換液。

l 離心換液法：

1. 準備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預熱）

2. 將所有細胞懸液轉移至離心管中；

3. 900-1000rpm，3min離心；

4. 棄上清，加5mL PBS輕輕重懸細胞進行潤洗，再900-1000rpm，3min離心；

Tips：此處PBS潤洗是為了去除細胞碎片，平時培養(yǎng)若細胞碎片不多可以忽略此步驟。

5. 培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；

6. 離心完成后棄上清，加適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細胞沉淀，將細胞懸液接種回培養(yǎng)瓶中，混勻細胞，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

NK-92細胞傳代方法

l 離心法：

1. 準備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預熱）

2. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內細胞懸液轉移至離心管中；

3. 900-1000rpm，3min離心收集細胞；

4. 在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）

5. 離心完成后，棄離心管內上清，然后加入適量新鮮培養(yǎng)基，輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后將細胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

l 直接分瓶法：

1. 輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細胞均勻分散；若有較大的細胞團，需吹散成小團。

2. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內細胞懸液，均分到若干個新培養(yǎng)瓶中，每瓶再補充適量的新鮮培養(yǎng)基，輕輕混勻后將細胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

Tips：

l 注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉速以及時間不要過高，避免細胞受機械損傷。

l 傳代比例推薦1：2

NK-92細胞凍存方法

1. 準備所需的培養(yǎng)基、PBS、血清、DMSO、離心管以及無菌槍頭等；（試劑需提前預熱）

Tips：若凍存前培養(yǎng)基已經變黃，先換液靜置培養(yǎng)4h左右，待細胞活力穩(wěn)定后再進行凍存。

2. 根據收集到細胞量，配制相應量的凍存液，并準備相應數量的凍存管，在凍存管上標志細胞名稱，代次，凍存時間等信息。推薦凍存液配方：90%FBS+10%DMSO；凍存密度300萬細胞/mL/管。

Tips：凍存密度過低將導致復蘇后狀態(tài)不佳。

3. 將細胞懸液轉移至離心管中1000rpm，3min離心收集細胞；

4. 離心完成后棄上清，加入相應量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細胞，將細胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度，不要產生過多氣泡；

Tips：加入凍存液混勻細胞后及時分裝并將細胞降溫凍存，以減少DMSO對細胞的毒性。

5. 將細胞放置程序降溫凍存盒中，再將凍存盒轉移至-80℃冰箱進行降溫凍存。

6. 次日（16h-24h后）復蘇一管檢查凍存效果，確認沒問題后及時將凍存細胞放置液氮中保存，細胞在-80℃冰箱放置時間不要超過3天。

NK-92細胞復蘇方法

1. 提前將水浴鍋預熱至37℃，培養(yǎng)基復溫至室溫或37℃，離心機設置好轉速；

2. 將凍存細胞從液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，快速搖晃至完*融化，融化時間不超過2min；

Tips：

l 若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

l 水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

3. 直接將凍存管900-1000rpm 2min離心，同時在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；

4. 離心完成后棄上清，吸取1mL新鮮培養(yǎng)基（建議血清濃度提高至20%）輕輕重懸細胞，吹散細胞后接種到培養(yǎng)瓶中；

5. 使用十字法或8字法將細胞混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

Tips：整個細胞復蘇過程在盡可能5-10min內完成。

NK-92細胞收貨攻略

1. 拆封包裝盒，確認細胞，說明書等是否齊全，收貨細胞名與所購買細胞是否符合；

2. 觀察細胞培養(yǎng)瓶是否完好，有無漏液，培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)基是否有肉眼可見的絮狀物或者渾濁等，發(fā)現異常及時拍照聯系銷售人員；

3. 確認無異常后，將培養(yǎng)瓶表面消毒，然后撕掉封口膜豎立放入培養(yǎng)箱平衡4h左右，讓懸浮細胞沉下培養(yǎng)瓶底部；

4. 平衡過程中可以仔細閱讀細胞說明書，知悉細胞所需培養(yǎng)體系，培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)注意事項等；

5. 平衡完成后豎立取出細胞培養(yǎng)瓶，此時大部分細胞沉在培養(yǎng)瓶底部，小心吸取上清至離心管中，保留10mL左右培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內，小心操作，盡量不要吸到沉在底部的細胞；

6. 將離心管1200rpm，5min離心收集未沉下培養(yǎng)瓶底部的細胞，上清可以4℃保存，后續(xù)用于培養(yǎng)細胞，以平穩(wěn)過度到自己的培養(yǎng)基。將收集到的細胞接種至原培養(yǎng)瓶；

7. 觀察細胞，根據細胞狀態(tài)，以及團塊數量、大小決定傳代或繼續(xù)培養(yǎng)。

常見問題及解決方案

培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可通過900-1000rpm，3min離心以去除部分碎片。少量碎片不影響細胞生長，不建議頻繁離心。

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